1.
Kulturelle Untersuchung

1.1
Als Untersuchungsmaterial sind Vaginal- oder Präputialspülproben, Spülproben von der Innenwand der künstlichen Scheide und Spermaproben zu verwenden. Zwischen der Entnahme und dem Anlegen der Kulturen darf kein längerer Zeitraum als 6 bis 8 Stunden liegen.

1.1.1
Als Spülflüssigkeit hat sich Thioglykolatbouillon bewährt, die als Fertignährboden bezogen oder nach folgendem Rezept hergestellt werden kann:

1.2
Zur kulturellen Isolierung der Vibrionen ist es erforderlich, daß die Begleitflora im Untersuchungsmaterial möglichst ausgeschaltet wird. Dies kann erreicht werden:

1.2.1
Durch Nährböden, die Hemmstoffe enthalten, z.B. Natriumthioglykolat-Nährboden (s. unter 1.1.1 angeführtes Rezept oder Fertignährboden) mit Zusatz von 2 % Agar, 10 % Rinderschüttelblut und 11,4 ml einer 0,22 %igen Brillantgrünlösung auf 1 Liter Nährboden oder

Natriumthioglykolat-Nährboden mit Zusatz von 2 % Agar, 10 % Rinderschüttelblut und Bacitracin (15 E/ml), Novobiocin (10 g/ml) und Polymyxin (2 E/ml).

1.2.1.1
Die Nährböden sind mit 2 bis 3 Ösen des Untersuchungsmaterials, evtl. nach kurzem Zentrifugieren (2 bis 5 Min.) vom Überstand, zu beimpfen.

1.2.2
Durch Filtration des Untersuchungsmaterials vor Beimpfung des Nährbodens. Die Spülproben sind kurz (2 bis 5 Minuten) zu zentrifugieren und 3 ml der überstehenden Flüssigkeit durch einen Filter mit 0,65 pm. Porenweite (besonders geeignet sind Injektionsspritzen aufsetzbare Filter) zu filtrieren; bei Samenproben sollten etwa 0,3 ml Spermaplasma mit 2,7 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt werden. Um eine Verstopfung der Filterscheiben zu vermeiden, können zusätzlich Mikroglasfaser-Vorfilterscheiben verwendet werden.

1.2.2.1
Von dem Filtrat werden 2 bis 3 Tropfen auf Natriumthioglykolat-Nährboden mit 2 % Agar und 10 % Rinderschüttelblut ohne hemmende Zusätze gebracht.

1.3
Die beimpften Platten sind 4 Tage in luftdicht verschließbaren Behältern (z. B. Zeißler-Töpfe), in denen ein Unterdruck von 0,8 at erzeugt wird, der durch Einleitung eines Gasgemisches aus 95 % Stickstoff und 5 % Kohlendioxyd bis auf 0,2 at vermindert wird, zu bebrüten.

1.4
Bei der Prüfung der Kulturen sind vibrionenverdächtige Kolonien mikroskopisch zu untersuchen. Hierzu eignet sich besonders die Untersuchung von Nativpräparaten im Phasenkontrast mit Ölimmersion, da bei diesem Verfahren neben der typischen Form der Bakterien auch ihre charakteristische Beweglichkeit erkennbar ist.

2.
Identifizierung von Vibrio fetus

Die von den Genitalschleimhäuten des Rindes isolierbaren Vibrionen lassen sich in der Regel auf Grund kulturellbiochemischen Verhaltens den Arten V. fetus und V. bubulus zuordnen:

2.1
Katalasenachweis

1 ml einer gut bewachsenen Leberbouillon ist mit 1 ml einer 3 %igen H₂O₂ Lösung zu mischen. Bei positivem Ausfall treten nach wenigen Sekunden Sauerstoffblasen auf.

2.2
H₂S-Nachweis

Nach Beimpfung einer Leberbouillon (vorher kurz aufkochen) wird ein Bleiazetatstreifen in das Röhrchen eingehängt. Eine positive Reaktion (Schwarzfärbung des Streifens) tritt nach 2 bis 3 Tagen Bebrütung auf.

2.3
Nachweis der Kochsalztoleranz

Natriumthioglykolatbouillon mit Zusatz von 0,1 % Agar und von 3,5 % Kochsalz ist mit 2 bis 3 Tropfen einer gut bewachsenen Leberbouillonkultur zu beimpfen. Wachstumskontrolle nach 48 Stunden Bebrütung durch makroskopische Beurteilung und mikroskopische Untersuchung eines Nativpräparates (bewegliche Vibrionen).

2.4
Stämme, die sich kulturell biochemisch wie V. fetus verhalten, müssen zur Unterscheidung von V. fetus (venerealis) und V. fetus (intestinalis) weiter differenziert werden.

2.4.1
Unterscheidungsmerkmale:

V. fetus (venerealis): keine Glvcintoleranz, O-Antigentyp 1, V. fetus (intestinalis): positive Glycintoleranz, O-Antigentyp2.

2.5
Nachweis der Glycintoleranz

Natriumthioglykolatbouillon mit Zusatz von 1 % Glycin ist mit 2 bis 3 Tropfen einer gut bewachsenen Leberbouillonkultur zu beimpfen. Wachstumsbeurteilung nach 48 Stunden wie in Nr. 2.3.

2.6
Serologische Differenzierung von Vibrio fetus

In Ausnahmefällen, in denen die kulturell-biochemischen Methoden keine eindeutigen Ergebnisse liefern, kann die Bestimmung des O-Antigens mit Hilfe der Komplementbindungsreaktion notwendig werden. Einzelheiten der Versuchstechnik s. E. Mitscherlich und B. Liess (1958): Die serologische Differenzierung von Vibrio-fetus-Stämmen, Dtsch. Tierärztl. Wschr. 65, 2-5, 36-39.